Камеры для флуоресцентной микроскопии

Флуоресцентная микроскопия – широко используемое понятие, охватывающее многочисленные направления. В биологических науках применяются как самые простые устройства, так и высокоспециализированные методы, которые помогают обнаруживать и распознавать буквально считаные фотоны или отдельные молекулы с помощью высококлассного аппаратного и программного обеспечения.

При выборе камеры для флуоресцентной микроскопии важно найти баланс между определенными характеристиками сенсора, свойствами камеры и требованиями, предъявляемыми для решения определенных задач в науке, медицине или промышленности.

Оптический формат и разрешение

Если речь идет о видимом диапазоне длин волн, факторы выбора оптической системы не сильно отличаются от обычных требований в световой микроскопии с точки зрения формата, увеличения и разрешения. Тем не менее важно знать, что общая стоимость системы увеличивается в случае выбора более крупных оптических форматов, например объективов F-Mount. Наиболее распространенным является стандарт C-Mount: такие объективы предлагают достаточно высокую оптическую производительность, и для них большая часть компонентов и решений предлагаются по разумной цене. Наименьший формат S-Mount станет хорошим выбором для разработки компактных устройств с более низкой себестоимостью. Квадратные сенсоры, как правило, предпочтительнее, поскольку обеспечивают съемку максимально информативного изображения.

Поскольку сенсор является ключевым компонентом системы обработки изображений, выбирая его, важно обращать внимание на конкретные характеристики производительности.

ПЗC, КМОП, sCMOS и BSI

Долгое время ПЗC-сенсоры были самой распространенной технологией на рынке флуоресцентных микроскопов. В последние годы ситуация изменилась, несмотря на то, что этими сенсорами по-прежнему оснащаются высококлассные камеры для микроскопии. Новая технология КМОП в последние годы приобретает все большую популярность, и ее конкурентоспособность по части решения особых задач в научной сфере также растет. Характеристика уровня шума в настоящее время сопоставима с уровнем, который обеспечивают традиционные ПЗC-сенсоры, или даже превышает его, при этом новая технология предлагает высокую скорость съемки, более высокое разрешение, сниженное энергопотребление и более эффективный теплоотвод – и все это по более низким ценам.

КМОП-сенсоры продолжают стремительно развиваться. В промышленных светочувствительных сенсорах стала применяться технология задней засветки (Backside Illumination – BSI). Эта технология основана на инверсированной пиксельной архитектуре, согласно которой светочувствительный фотодиод располагается непосредственно под микролинзами, что значительно повышает квантовую эффективность пикселей (рис. 1).

Рис. 1. Пиксели с передней засветкой (слева) и задней засветкой (справа).

Рис. 2. Наличие красных, зеленых и синих цветных фильтров на пикселях снижает квантовую эффективность цветной камеры по сравнению с монохромной камерой. Кроме того, цветные камеры обычно оснащаются ИК-фильтром, который блокирует свет в диапазоне от 650 до 700 нм и выше.

Монохромная или цветная

Монохромные камеры, как правило, предпочтительнее для флуоресцентных микроскопов ввиду их более высокой квантовой эффективности. Технический фактор, обусловивший эту разницу, заключается в том, что в цветных камерах на каждом пикселе установлены микрофильтры Байера, которые пропускают свет только определенной длины волны. Такая фильтрация необходима для вычисления цветовых значений каждого пикселя изображения по методу дебайеризации. Поскольку цветные фильтры блокируют определенное количество света, меньше фотонов достигают светочувствительной поверхности пикселя. Помимо фильтра Байера сенсоры в цветных камерах оснащаются ИК-фильтром, который представляет собой еще один ограничивающий фактор, поскольку блокирует свет в диапазоне примерно от 650 до 700 нм и выше (рис. 2).

Как правило, изображения с несколькими флуоресцирующими красителями для точного обнаружения локализованных молекул, представляющих интерес для исследования, получают путем объединения отдельных изображений от монохромных камер. Возможность выбора источников света и наборов фильтров обеспечивает подходящую комбинацию возбуждающих и испускаемых длин волн для каждого используемого флуорофора (рис. 3).

Тем не менее в некоторых случаях может требоваться получение цветных и флуоресцентных изображений с помощью одного прибора и с использованием всего одной камеры. Это возможно, если требования к чувствительности для флуоресцентной съемки не слишком высоки.

Рис. 3. Два флуоресцентных изображения коммерчески доступного бычьего легочного артериального эндотелиального клеточного субстрата (BPEA), полученные с помощью монохромной камеры Basler MED ace разрешением 2,3 Мп, оснащенной КМОП-сенсором IMX174 с передней засветкой. Отдельные изображения, на которых представлены различные клеточные структуры, затем окрашиваются в ПО и объединяются в одно изображение, на котором присутствуют обе структуры.

Технологии глобального и скользящего затвора

ПЗC-сенсоры оснащаются затвором только одного типа (глобальным), тогда как КМОП-сенсоры предлагаются в двух вариантах: со скользящим или глобальным затвором. Качество изображения, особенно в случае движущихся объектов съемки, в значительной мере обусловлено выбором подходящей технологии затвора. В сенсорах с технологией скользящего затвора пиксели подвергаются воздействию света строка за строкой. В результате, если объект изменил свое положение во время экспозиции строки, возникают артефакты в виде искажения пространства на изображении. Техническим преимуществом сенсоров с технологией скользящего затвора является то, что пиксели оснащены меньшим количеством электронных компонентов, что способствует снижению уровня шума во время считывания. В то же время в сенсорах с технологией глобального затвора обеспечивается одновременная экспозиция всех пикселей. В этом случае сдвиг во времени между экспозицией различных строк пикселей отсутствует, а значит, артефакты искажения пространства при перемещении объектов съемки не возникают.

Чувствительность и динамический диапазон

Прежде чем изучать вопрос качества изображения, важно убедиться, что система достаточно чувствительна для съемки флуоресцентных сигналов, которые могут оказаться очень слабыми, в зависимости от конкретных условий. Под чувствительностью понимается минимальное количество света, необходимое для генерации сигнала, который можно отличить от шума. Важной характеристикой здесь является квантовая эффективность (КЭ), которая описывает отношение числа падающих фотонов от источника света к числу преобразованных пикселем электронов. Она зависит от длины волны, и чтобы получить наилучший результат, спектральные характеристики сенсора должны соответствовать спектрам излучения применяемых флуорофоров. Чем выше КЭ, тем эффективнее преобразование фотонов, что позволяет сократить длительность экспозиции, а значит, снизить риск засвечивания флуорофоров и потенциально повысить общую скорость обработки изображения.

Кроме того, возможность зафиксировать широкий спектр уровней яркости света в одну экспозицию несет определенные преимущества. В этом отношении актуальной характеристикой является полная емкость потенциальной ямы. Она означает максимальное количество электронов, которое способен преобразовать один пиксель за одну экспозицию. Чем выше полная емкость потенциальной ямы, тем больше света поглощается пикселем до достижения уровня насыщения, что сокращает необходимость в дополнительной экспозиции.

Понятие динамического диапазона объединяет это максимальное количество электронов и наименьшее количество электронов, необходимое для получения истинного сигнала (см. «шум считывания» в следующем разделе) и характеризует общую способность камеры измерять и различать различные уровни яркости света.

Наконец, используется характеристика абсолютного порога чувствительности, которая выражается в количестве фотонов, необходимом для достижения соотношения «сигнал – шум» (SNR), равного 1, когда сигнал эквивалентен шуму. Чем меньше это значение, тем меньше света требуется для получения истинного сигнала. Поскольку здесь не учитывается размер пикселя, невозможно провести сравнение двух камер по этой характеристике, если они оснащены сенсорами с пикселями разного размера.

Качество изображения и шум

Шум – это расхождение между значением истинного сигнала и значением, которое производится измерительной системой. Соотношение «сигнал – шум» представляет собой количественное выражение общего уровня шума системы машинного зрения при определенном уровне освещенности и является распространенной характеристикой, используемой для сравнения камер. Чем выше соотношение «сигнал – шум», тем выше качество изображения. В обработке изображений встречаются типы шумов, которые исключительно редко – если вообще в принципе возможно уменьшить с помощью технологий камеры (например, фотонный/дробовой шум, который вызывается физическим проявлением фотонов). Однако другие типы шумов, влияющие на качество изображения, в значительной мере зависят от используемого сенсора и технологий камеры. В последние годы современные КМОП-сенсоры превзошли ранее широко распространенную технологию ПЗC по характеристикам качества изображения и производительности. Шум считывания – или темновой шум – это шум, добавляемый к сигналу на каждое событие затвора, который выражается в электронах на пиксель. В современных КМОП-сенсорах шум считывания составляет всего 2 e¯/пиксель (рис. 4).

Рис. 4. Сравнение шумовых свойств (временной темновой шум) камер с технологией ПЗC и КМОП при длительности экспозиции 10 мс.

Рис. 5. Сравнение шумовых свойств (шум темнового тока) камер с технологией ПЗC и КМОП при длительности экспозиции 4 миллисекунды. Предоставлено Basler AG.

Другой источник шума, актуальный для флуоресцентной съемки, приобретает важность при увеличении длительности экспозиции и вызывается темновым током. Темновой ток представляет собой утечку электронов во время экспозиции и выражается в электронах на пиксель в секунду (рис. 5). Как правило, темновой ток удваивается с каждым повышением температуры на 7 °C.

Типы шумов, которым свойственно не временное, а пространственное поведение, относятся к шуму с постоянным спектром. Он возникает в результате отклонений, которые обнаружить между пикселями. Такой шум вызывается электронной схемой пикселя или неоднородностью температур над поверхностью сенсора.

Стандартизированными количественными показателями этих типов шумов являются неоднородность темнового сигнала (DSNU), которая означает отклонение в произведенных электронах без какого-либо светового сигнала, и неоднородность квантового выхода (PRNU), которая означает расхождение между пикселями при определенном уровне освещенности. Путем установки предельных значений расхождения между пикселями можно затем выявить пиксели с резко отклоняющимися значениями яркости и определить их как дефектные, например, найти «горячие» пиксели, которые показывают высокий уровень яркости без соответствующего сигнала. Некоторые производители камер устраняют дефектные пиксели на этапе контроля качества путем интерполяции на основе данных от соседних пикселей, чтобы интеграторам не мешали эти артефакты.

Интерфейсы

На рынке предлагаются камеры с различными интерфейсами передачи данных. Чтобы принять решение о том, какой интерфейс подходит для решения ваших задач, необходимо принять во внимание следующие факторы: Скорость передачи данных/съемки, длина кабеля, стандарт, усилия на интеграцию и себестоимость. Интерфейсы USB 3.0 (носивший наименование 3.2 Gen 1) и GigE представляют собой современные технологии передачи данных для флуоресцентной микроскопии. Стандарты машинного зрения предлагаются на оба этих интерфейса и содержат спецификации, разработанные ведущими производителями камер в целях усовершенствования конструкции и повышения производительности систем машинного зрения, а также сокращения усилий системных интеграторов.

USB 3.2 Gen 1 – традиционный и устоявшийся интерфейс Plug-and-Play с простейшей интеграцией. Он обеспечивает скорость передачи данных 380 МБ/с, то есть, например, позволяет вести съемку со скоростью 75 кадр/с на разрешении 5 Мп, что является достаточным в большинстве областей. Допустимая длина кабеля составляет несколько метров, включая источник питания. Кроме того, поддерживается интеграция нескольких камер. Интерфейс GigE используется в случаях, когда необходимы более длинные кабели и более точная синхронизация нескольких камер. Пропускная способность GigE в 3,8 раза ниже (100 Мб/с) по сравнению с USB. У обоих интерфейсов уже вышли новые версии с более высокой пропускной способностью (до четырех раз). Тем не менее, им еще только предстоит утвердиться на рынке, где также должны появиться соответствующие периферийные устройства.

Охлаждение

Температура сенсора является критическим фактором появления темнового тока, который ухудшает соотношение «сигнал – шум» и качество изображения, в особенности в случае слабого светового сигнала, когда необходима более длительная экспозиция. Это означает, что охлаждение камер может играть важную роль, но не является абсолютно необходимым для флуоресцентной съемки. Поскольку использование охлаждающих установок существенно увеличивает стоимость системы, в большинстве камер не предусмотрено активное охлаждение, что является достаточным в случае хорошего флуоресцентного сигнала. Но даже в таких камерах конструкция влияет на температуру сенсора. Чтобы предотвратить тепловыделение, следует выбирать камеру с низким энергопотреблением. Кроме того, тепло должно эффективно отводиться от камеры за счет внутренней аппаратной конструкции и путем установки камеры на теплорассеивающий держатель.

Для активного охлаждения сенсора можно использовать термоэлектрические охлаждающие элементы Пельтье, а встроенный вентилятор обычно рассеивает тепло, генерируемое элементом Пельтье. Вентилятор также помогает предотвратить конденсацию влаги, когда температура опускается ниже температуры окружающей среды. Если необходимо избежать вибрации (которую вызывает вентилятор), в некоторых случаях для камер используется даже водяное охлаждение.

Улучшения с помощью встроенного программного обеспечения

Помимо характеристик сенсора и других аппаратных компонентов, улучшить качество изображения в условиях низкой освещенности можно с помощью функций встроенного ПО.

Одним из примеров является коррекция дефектных пикселей. С этой целью производитель на этапе заключительного контроля качества проводит съемку камерой с разной длительностью экспозиции, и обнаруженные дефектные пиксели сохраняются в кэш-памяти камеры. В режиме эксплуатации значения дефектных пикселей интерполируются на основе взвешенной суммы значений уровня яркости, зафиксированных прилегающими к ним пикселями. Это повышает качество изображения и соотношение «сигнал – шум».

Современное поколение КМОП-сенсоров открывает возможности для решения задач, которые ранее считались невыполнимыми без инвестиций в размере нескольких тысяч евро в ПЗC-камеру. Эти новые возможности продолжают расширяться, и флуоресцентные методы все чаще применяются в биологических науках для визуализации структур и процессов.

Флуоресцентные методы

Флуоресценция представляет собой физическое явление, а не конкретную технологию. Число возможных методов, применяемых в биологических науках, – например, для анализа, количественного подсчета или визуализации, – практически бесконечно. Флуорофоры можно сочетать с различными носителями, такими как белки (часто антитела), нуклеиновые кислоты или микрочастицы, однако они также могут быть введены в качестве генных маркеров в организмы с целью изучения биологических функций и процессов живых клеток. Помимо биологических наук флуоресцентные методы применяются и в других областях, таких как анализ материалов и судебно-медицинская экспертиза. На примерах ниже демонстрируется многообразие областей применения флуоресцентных методов.

В лабораторной диагностике, например в диагностике аутоиммунных или инфекционных заболеваний, для выявления специфических антител в крови пациента используется метод, называемый непрямой реакцией иммунофлуоресценции.

Помимо ручной микроскопии уже существуют автоматизированные системы, которые предлагают лабораторным врачам возможные результаты исследования на основе анализа программным обеспечением характера флуоресценции клеток, выращенных в сыворотке крови пациента (рис. 6). Другая система, в свою очередь, проводит анализ сыворотки крови пациента на наличие возбудителей малярии менее чем за три минуты. Анализ выполняется на основе визуальных алгоритмов, в которых также учитываются флуоресцентные сигналы.

Рис. 6. Система компьютеризованной иммунофлуоресцентной микроскопии EUROPattern (EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG, Германия) для диагностики аутоиммунных и инфекционных заболеваний, оснащенная КМОП-камерами Basler ace для получения флуоресцентных изображений. Предоставлено Basler AG.

Рис. 7. Ручной иммунофлуоресцентный микроскоп с камерой Basler MED ace. Предоставлено Basler AG.

В медицинской диагностике все большее значение приобретают портативные диагностические системы. Помимо прочих преимуществ, благодаря простоте использования и невысокой стоимости они позволяют повысить качество медицинского обслуживания даже в регионах со слабой экономикой и недостаточно развитой инфраструктурой. Микрожидкостные (Lab-on-a-Chip) технологии делают возможным анализ биологических образцов пациента с помощью миниатюрного чипа, без сложного лабораторного оборудования.

В хирургической микроскопии оперирующие врачи все чаще используют определенные флуоресцентные красители для маркировки кровеносных сосудов или тканей опухоли в целях повышения точности операции (флуоресцентная хирургия). Стоматологи также предлагают более точное и быстрое лечение с применением флуоресцентных методов, например, окрашивая участки зуба, пострадавшие от кариеса, что делает их избирательно видимыми. Наконец, но не в последнюю очередь, флуоресцентная микроскопия используется в патологии для исследования тканей, взятых у пациента путем биопсии, на наличие возможных заболеваний.

В биологических науках применяются самые разнообразные флуоресцентные методы, значительную долю которых составляют микроскопические исследования. Иммунофлуоресцентная микроскопия делает возможным точное обнаружение определенных белков, например, с целью выявления или уточнения их локализации в клетках и тканях или использования в качестве маркеров начала гибели клеток, в зависимости от условий конкретного исследования (рис. 7). В настоящее время также существует возможность визуализации процессов в живых клетках за более длительные периоды времени в автоматизированном режиме.

В фармацевтических исследованиях особое значение для повышения производительности приобретают миниатюризация и распараллеливание, поскольку в поисках новых активных веществ проводится анализ очень большого количества образцов. Именно в этой сфере широко применяются микроматрицы и высокопроизводительные системы анализа (рис. 8).

При наличии автоматизированных устройств для подсчета колоний флуоресцирующие красители наносятся в чашках Петри на успешно трансфицированные клетки для последующего забора образца соответствующей колонии. Наличие красителя подтверждает перенос определенного генетического материала в клетку в рамках эксперимента, чтобы ученые могли продолжать ее исследование.

Рис. 8. Иммунофлуоресцентный микроскопический анализ в аутоиммунной диагностике (слева). Микроматрица ДНК, используемая в исследованиях рака и других заболеваний (справа).