형광 현미경 검사용 카메라
형광 현미경 검사용 카메라를 선택할 때에는 특정 센서의 특성, 카메라 관련 특성, 그리고 과학, 의학 또는 산업 분야에서 사용할 애플리케이션의 요구사항 사이의 균형을 찾는 것이 중요합니다.
광학 포맷 및 해상도
가시적 파장 범위를 살펴보면 광학 설정과 관련된 고려 사항은 포맷, 배율 및 해상도 측면에서 일반적인 광학 현미경 검사 애플리케이션과 크게 다르지 않습니다. 그러나 F-마운트처럼 더 큰 광학 포맷을 사용할 경우 전체 비용이 증가한다는 점을 반드시 기억해야 합니다. 가장 일반적으로 사용되는 것은 C-마운트 제품으로 매우 우수한 광학 성능을 제공하며 이 마운트는 합리적인 비용으로 대부분의 제품 및 솔루션에 사용할 수 있습니다. S-마운트는 크기가 제한적이고 비용이 낮은 기기를 개발할 때 적합합니다. 최대 이미지 콘텐츠를 캡처하는 경우에는 사각 센서가 선호되는 경우가 많습니다.
센서는 이미징 시스템에서 중요한 역할을 하므로 센서를 선택할 때에는 특정 성능 사양을 고려하는 것이 매우 중요합니다.
CCD, CMOS, sCMOS 및 BSI
CCD 센서는 매우 오랜 시간 동안 형광 현미경 검사 시장에서 대표적인 기술로 인정 받았습니다. CCD 센서는 여전히 고품질 현미경 검사용 카메라에서 사용되고 있지만 최근 몇 년 사이에 그 입지가 약화되었습니다. 최신 CMOS 기술은 최근 몇 년 동안 사용 범위가 점차 확대되고 있으며 과학 분야에서의 특수한 문제에 대해 경쟁력 있는 대안을 제시합니다. CMOS 센서의 노이즈 수준은 이제 기존의 CCD 센서와 비슷하거나 훨씬 더 우수해졌습니다. 뿐만 아니라 CMOS 센서는 새로운 기술을 통해 빠른 속도, 고해상도 및 낮은 전력 소비/열 방출 등의 요구 사항을 더욱 합리적인 가격으로 충족할 수 있습니다.
CMOS 센서는 여전히 빠르게 발전하고 있으며, 후면 조사(BSI)이라는 기술이 산업용 이미지 센서에 적용되었습니다. 이 기술은 픽셀 구조를 반전시켜 빛에 민감한 광다이오드를 마이크로렌즈 바로 아래에 제시하며 그 결과 픽셀의 양자 효율이 크게 향상됩니다(그림 1).
모노크롬 및 컬러
모노크롬 카메라는 양자 효율성이 더 높기 때문에 형광 애플리케이션에서 일반적으로 선호됩니다. 이러한 차이를 만드는 기술적 요인은 컬러 카메라에서 각 픽셀의 베이어 마이크로필터가 특정 파장만을 통과시키는 것입니다. 이러한 필터링 작업은 디베이어링이라는 프로세스를 사용하여 이미지의 색상 정보를 계산하기 위해 필요합니다. 컬러 필터는 일정량의 빛을 차단하기 때문에 픽셀의 광자 반응 영역에 도달하는 광자의 수가 줄어듭니다. 센서의 베이어 패턴과 더불어, 컬러 카메라의 적외선 차단 필터는 약 650~700nm 이상의 빛을 차단하기 때문에 제한 요인으로 작용합니다(그림 2).
일반적으로 관심 대상 분자를 구체적으로 감지하고 공동 위치를 파악하기 위한 형광 표지가 여러 개 포함된 이미지는 모노크롬 카메라를 사용하여 별도의 이미지에서 만들어집니다. 선택 가능한 광원과 필터 세트는 사용되는 각각의 형광등에 대해 여기(excitation) 파장과 방출(emission) 파장의 적절한 조합을 제공합니다(그림 3).
그러나 일부 애플리케이션에서는 단 한 대의 카메라를 사용하여 한 기기 내에서 컬러 이미징 및 형광 작업을 수행하고자 하는 요구사항이 발생할 수 있습니다. 이는 형광 애플리케이션의 민감도 요구사항이 크게 높지 않은 경우에 가능합니다.
글로벌 셔터 및 롤링 셔터
CCD 센서에는 하나의 셔터 유형(글로벌)만 있는 반면 CMOS 센서에는 롤링 및 글로벌이라는 두 가지 유형의 셔터가 제공됩니다. 올바른 센서를 선택하는 것은 특히 대상 오브젝트가 이동하는 경우에 이미지 품질에 상당한 영향을 미칩니다. 롤링 셔터 센서에서 픽셀은 한 라인씩 노출됩니다. 따라서 두 라인의 신호 캡처 사이에 위치가 변경된 오브젝트는 이미지 상황을 왜곡하여 이미지에 공간 왜곡을 발생시킵니다. 롤링 셔터 센서의 기술적 이점은 픽셀에 전자 부품이 적게 들어 판독 중에 노이즈가 감소할 수 있다는 것입니다. 한편, 글로벌 셔터 센서는 센서의 모든 픽셀을 동시에 노출시킵니다. 이 경우 서로 다른 픽셀 라인의 노출 사이에 시간 변화가 없으므로 오브젝트가 이동할 때 공간 왜곡이 발생하지 않습니다.
민감도 및 다이내믹 레인지
이미지의 화질을 자세히 살펴보기 전에 시스템이 개별 애플리케이션에 맞게 매우 약한 형광 신호를 캡처할 수 있을 만큼 민감하게 반응하는지 확인하는 것이 중요합니다. 민감도는 노이즈와 구별할 수 있는 신호를 생성하는 데 필요한 최소한의 빛의 양으로 이해할 수 있습니다. 중요한 값은 광원의 입사 광자와 픽셀의 생성된 전자 사이의 비율을 나타내는 양자 효율(QE)입니다. 양자 효율은 파장에 따라 달라지며, 특정 센서의 스펙트럼은 최상의 결과를 얻기 위해 애플리케이션에서 형광 발색단의 방출 스펙트럼에 적합해야 합니다. QE가 높을수록 광자의 수율이 증가하여 노출 시간이 단축되고, 형광 발색단의 광 표백이 감소하며, 잠재적으로 전체 이미징 속도가 향상됩니다.
많은 경우에 한 번의 노출로 해결할 수 있는 다양한 광도를 확보하는 것이 도움이 되기도 합니다. 여기에서 관련이 있는 개념은 풀웰커패시티(Full well capacity)로 이 용어는 노출 1회당 하나의 픽셀을 통해 생성될 수 있는 최대 전자 수를 나타냅니다. 풀웰커패시티가 클수록 픽셀이 포화되기 전에 더 많은 빛을 캡처할 수 있으므로 포화로 인한 추가 노출이 줄어듭니다.
실제 신호를 생성하는 데 필요한 최대 전자 수와 최소 전자 수(다음 섹션의 "노이즈 판독" 참조)를 결합한 다이내믹레인지는 다양한 수준의 빛을 측정하고 구별할 수 있는 카메라의 전반적인 기능을 나타냅니다.
마지막으로, 절대 민감도 임계값은 1의 신호대잡음비(SNR)를 생성하기 위해 하나의 픽셀에 필요한 광자의 수입니다. 즉, 이는 신호가 노이즈와 동일하다는 것을 의미합니다. 이 값이 작을수록 실제 신호를 생성하는 데 필요한 빛이 줄어듭니다. 이 개념은 픽셀 크기를 고려하지 않기 때문에 두 카메라의 픽셀 크기가 다른 경우 두 카메라를 비교하는 데 직접 사용할 수 없습니다.
이미지 품질 및 노이즈
이미지 품질 및 노이즈
노이즈는 실제 신호 값과 측정 시스템에서 생성되는 값 사이의 편차입니다. SNR은 특정 광 레벨에서 영상 시스템의 전체 노이즈를 정량화하고 카메라를 비교하는 데 사용되는 일반적인 변수입니다. SNR이 높을수록 이미지의 품질이 향상됩니다. 이미징 프로세스에는 노이즈 감소가 아예 불가능하거나, 가능하다면 카메라 기술(예: 광자의 물리적 외관에 의해 발생하는 광자/샷 노이즈)에 의해 거의 극소량만 감소시킬 수 있는 유형의 노이즈들이 있습니다. 그러나 이미지 품질에 영향을 미치는 그 밖의 노이즈 유형은 센서 자체와 카메라 기술의 영향을 크게 받습니다. 최근 몇 년 동안 최신 CMOS 센서들은 이미지 품질 및 성능 면에서 기존의 CCD 기술을 추월했습니다. 판독 노이즈(즉, 템포럴 다크 노이즈)는 셔터 이벤트당 신호에 추가되는 노이즈로서 e¯/픽셀 단위로 제공됩니다. 최신 CMOS 센서는 판독 노이즈가 2 e¯/픽셀 수준으로 감소합니다(그림 4).
노출 시간이 증가할 경우, 형광 애플리케이션과 관련된 또 다른 노이즈 소스가 중요해집니다. 이 노이즈 소스는 다크커런트(dark current)에 의해 발생합니다. 다크커런트는 노출 중 전자 동안 발생하는 누출이며 e¯/픽셀/초로 표시됩니다(그림 5). 일반적으로 다크커런트는 온도가 7°C 증가할 때마다 두 배로 증가합니다.
시간적 동작이 아니라 공간 관련 특성을 나타내는 노이즈 유형을 고정 패턴 노이즈라고 합니다. 이 유형은 서로 다른 픽셀 사이에서 볼 수 있는 편차를 설명하며, 픽셀 전자 장치 또는 센서 영역의 온도 변화로 인해 발생할 수 있습니다.
이러한 노이즈 유형에 대한 표준화된 정량화 측정값은 빛 신호 없이 생성된 전자의 편차를 설명하는 DSNU(다크 시그널 불균일성, dark signal non uniformity)와 특정한 빛 수준에서 픽셀 대 픽셀 편차를 설명하는 PRNU(광자 반응 불균일성, photoresponse nonuniformity)입니다. 픽셀 대 픽셀 편차에 컷오프 값을 설정하면 대응되는 신호 없이도 높은 그레이 값을 표시하는 핫픽셀과 같은 디펙트 픽셀(defect pixel)을 추가로 구별하고 설명할 수 있습니다. 일부 카메라 제조업체는 이미 인접 픽셀의 보간을 통해 품질 제어 작업 중에 디펙트 픽셀을 수정하여 통합 장치가 이러한 아티팩트에 의해 손상되지 않도록 합니다.
인터페이스
시장에는 다양한 인터페이스들이 있습니다. 어떤 인터페이스가 필요한지 결정하기 위해서는 애플리케이션에 따라 데이터/이미지 속도, 케이블 길이, 표준화, 통합 노력 및 비용 등과 같은 사항을 고려해야 합니다. 인터페이스 기술인 USB 3.0(3.2 Gen 1)과 GigE는 형광 현미경 검사 기반 시스템에 통합하기 위한 최신 기술을 나타냅니다. 비전 표준은 이 두 가지 인터페이스 모두에 사용할 수 있으며 카메라 시스템 통합 설치업체를 위해 비전 시스템의 설계, 작업 및 성능을 개선하고자 하는 대표적인 카메라 제조업체에 의해 개발된 사양을 제공합니다.
USB 3.2 Gen 1은 가장 간단한 통합 기능을 갖춘 기존의 플러그앤플레이 인터페이스로서 380MB/s의 데이터 속도를 허용합니다. 즉, 5MP에서 75fps를 사용할 수 있으므로 대부분의 애플리케이션에 충분한 속도를 지원합니다. 멀티 카메라의 통합과 마찬가지로 전원 공급을 포함한 케이블 길이가 최대 수 미터까지 지원됩니다. GigE는 더 긴 케이블과 여러 카메라간의 보다 정확한 동기화가 필요할 때 사용됩니다. GigE 대역폭은 위에서 언급한 USB보다 3.8배(100MB/s) 느립니다. 두 인터페이스 모두 최대 4배 더 높은 대역폭을 가진 새 버전이 이미 출시되었습니다. 그러나 이 인터페이스들은 시장에서 그 성능이 입증되어야 하며, 이를 위해서는 해당 하드웨어 주변 디바이스를 사용할 수 있어야 합니다.
냉각
센서의 온도는 다크커런트에 핵심적인 영향을 미치므로 SNR 및 이미지 화질이 악화되며, 이러한 특성은 특히 광 신호가 약하고 노출 시간이 더 긴 경우에 더욱 심화됩니다. 이것은 카메라를 냉각시키는 것이 중요할 수 있지만 형광 이미징에 꼭 필요한 것은 아니라는 것을 의미합니다. 냉각을 위한 조치는 시스템 비용에 상당한 영향을 미치기 때문에 대부분의 카메라에서는 냉각 기능이 능동적으로 작동하지 않으며, 이러한 기능은 이미 형광 신호가 양호한 애플리케이션에는 불필요합니다. 하지만 이 카메라들에서도, 설계는 센서 온도에 영향을 미칩니다. 낮은 전력 소비량으로 카메라를 작동하여 열을 발생시키지 않아야 합니다. 또한 내부 하드웨어 설계 및 다른 열 방출 캐리어에 카메라를 장착하여 열을 효율적으로 외부로 이동시켜야 합니다.
열전(펠티어) 요소는 센서를 능동적으로 냉각하는 데 사용되며, 일반적으로 통합 팬은 펠티어 요소에 의해 발생하는 열을 외부로 방출합니다. 또한 이 팬은 온도가 주변 온도 아래로 떨어질 때 응축 습기를 방지하는 데 도움이 됩니다. (팬에 의해 발생할 수 있는) 시스템의 진동을 방지하야 할 경우, 일부 카메라는 물 기반 냉각 방식을 활용합니다.
펌웨어를 통한 개선
하드웨어 및 센서 사양 이외에도 카메라는 낮은 조명 조건에서 이미지 품질을 향상시키는 펌웨어 기능을 제공할 수 있습니다.
이와 관련해 디펙트 픽셀 보정을 예로 들 수 있습니다. 이를 위해 제조업체는 최종 검사가 진행되는 동안 카메라를 다양한 노출 시간에서 작동시키고 불량 픽셀은 카메라의 캐시에 저장됩니다. 작동 모드에서 불량 픽셀 값은 인접 픽셀의 가중치 합계에 의해 보간됩니다. 이렇게 하면 이미지 품질과 SNR을 개선할 수 있습니다.
현재의 CMOS 센서 세대는 이전에 CCD 카메라에서 수천 유로를 투자해야 했던 애플리케이션을 실현합니다. 생명과학 분야에서 구조 및 프로세스를 시각화하기 위해 형광이 점점 더 폭넓게 사용되는 상황에서 이처럼 새로운 가능성은 그 중요성이 지속적으로 증가하고 있습니다.
다양한 분야에서 사용되는 형광
형광은 물리적인 현상으로서 특정한 기술이 아닙니다. 생명 과학에서 분석, 정량적 판단, 시각화 등을 위해 사용 가능한 방법은 거의 무한합니다. 형광 발색단은 단백질, 핵산 또는 마이크로 입자와 같은 다양한 전달체와 결합될 수 있습니다. 또한 세포-생물학적 기능 및 프로세스를 조사하기 위해 유기체 내 유전자 기술 표지로도 통합될 수 있습니다. 형광 기반 방법은 생명 과학 분야 외에도 재료 분석 또는 포렌식 같은 다양한 분야에서 사용됩니다. 다음 사례들은 형광을 활용할 수 있는 다용도 애플리케이션 옵션을 보여줍니다.
자가면역질환 또는 감염질환의 체외진단에서는 간접면역 형광 현미경 검사 기술을 사용하여 환자의 혈액 내 특정 항체를 검출할 수 있습니다.
수동 현미경 검사 외에도 소프트웨어에서 평가한 환자 혈청과 함께 배양된 세포의 형광 패턴을 기반으로 실험실 의사에게 유의미한 결과를 제공하는 자동 시스템이 이미 존재합니다(그림 6). 또 다른 시스템은 말라리아 병원균에 대한 환자의 혈청을 3분 만에 분석합니다. 이러한 분석 작업은 형광 신호를 검토하는 비전 기반 알고리즘을 사용하여 수행됩니다.
의료 진단 분야에서 현장 진단(POS) 시스템의 중요성은 점점 더 증가하고 있습니다. 이 시스템은 무엇보다도 단순하고 비용 경제적인 애플리케이션을 통해 경제적 낙후 지역 또는 인프라가 부족한 지역에서도 더 나은 의료 서비스를 구축할 수 있도록 해줍니다. 랩온어칩(Lab-on-a-chip) 기술을 사용하면 복잡한 연구실 장비 없이도 소형 칩에서 환자 샘플을 처리할 수 있습니다.
외과의사는 혈관 또는 종양 조직에 대한 특수 형광 표지를 활용하여 보다 편리하게 수술용 현미경 검사를 진행하고 있으며, 형광 유도 수술로 완벽한 정밀도의 수술을 실현할 수 있습니다. 또한 치과의사들은 치료 중에 충치의 영향을 받는 치아 부위를 선택적으로 시각화하여 더욱 빠르고 구체적인 치료를 제공할 수 있습니다. 마지막으로, 형광 현미경 검사 애플리케이션은 병리학 분야에서 발병 우려가 있는 환자에 대한 생체검사에서 조직을 검사하는 데 활용됩니다.
생명과학 분야에서는 매우 다양한 형광 기반 애플리케이션을 제공되며 이 애플리케이션에서는 현미경 검사가 큰 비중을 차지합니다. 면역 형광 현미경은 특정한 단백질의 검출을 가능하게 합니다. 예를 들어, 현미경 검사를 통해 특정한 테스트 조건에 따라 세포 및 조직에서 특정 단백질을 감지하거나 정확한 위치를 파악하고, 또는 단백질을 세포의 사멸 시작을 나타내는 표지로 활용합니다.(그림 7) 오늘날, 라이브 셀 이미징 작업은 자동 시스템에서 더 오랜 시간 동안 수행될 수도 있습니다.
분석 수를 늘리기 위한 소형화 및 병렬 처리 작업은 제약 연구에서 특히 중요합니다. 새로운 활성 물질을 찾기 위해 다량의 샘플에 대한 분석적인 검사가 진행되기 때문입니다. 이 과정에서 마이크로 어레이 및 HCS 시스템(high-content screening system)이 사용됩니다(그림 8).
자동 군집 카운터를 통해 페트리 접시에서 형광 표지를 사용하여 감염된 세포를 성공적으로 선별하고 나중에 각 군집 샘플을 선택할 수 있습니다. 이것은 특정 유전 물질이 실험의 일부로서 세포로 실제로 전달되었는지를 검증한다는 것을 의미하며, 연구원들은 연구를 위해 이 물질을 계속 사용할 수 있습니다.