Caméras pour la microscopie à fluorescence OEM
La microscopie à fluorescence est un terme très large qui couvre de nombreuses applications. Cela va des applications de base dans les sciences de la vie aux techniques hautement développées dans lesquelles seuls quelques photons ou molécules individuels sont détectés et localisés par du matériel et des logiciels haut de gamme spécifiques.
Capteurs CMOS dans les applications basées sur la fluorescence
Dans de nombreux systèmes, tels que ceux utilisés pour des applications médicales, scientifiques ou de diagnostic clinique impliquant des méthodes basées sur la fluorescence, les capteurs CCD doivent être remplacés par des capteurs CMOS. Ce livre blanc fournit des informations sur le choix d'une caméra appropriée et explique les considérations techniques qui s'y rapportent.
Lorsque vous choisissez une caméra pour la microscopie à fluorescence, il est important de trouver un équilibre entre certaines propriétés du capteur, les aspects liés à la caméra et les besoins des applications prévues dans les domaines de la science, de la médecine ou de l'industrie.
Format optique et résolution
Dans le domaine des longueurs d'onde visibles, les considérations relatives à la configuration optique ne diffèrent pas sensiblement des applications de microscopie optique normales en termes de format, de grossissement et de résolution. Cependant, il est important de savoir que le coût global augmente lorsque des formats optiques plus grands tels que les montures F sont utilisés. La monture C est la plus courante, elle offre de très bonnes performances optiques et la plupart des produits et solutions sont disponibles à un prix raisonnable. La monture S, plus petite, est un bon choix lorsque des instruments de taille limitée et de moindre coût sont développés. Les capteurs carrés sont souvent préférables pour capturer le maximum d'images.
Le capteur jouant un rôle clé dans un système d'imagerie, il est très important de prendre en compte des spécifications de performance particulières lors de la sélection.
CCD, CMOS, sCMOS et BSI
Pendant longtemps, les capteurs CCD ont été la technologie établie sur le marché des microscopes à fluorescence. Cette situation a changé au cours des dernières années, même s'ils sont toujours disponibles dans les caméras de microscopie de haute qualité. La technologie CMOS, plus récente, s'est imposée ces dernières années et est devenue compétitive face aux défis particuliers du domaine scientifique. Les niveaux de bruit sont désormais comparables, voire supérieurs, à ceux des capteurs CCD traditionnels. Dans le même temps, la nouvelle technologie permet d'atteindre des vitesses plus élevées, des résolutions plus importantes et une consommation d'énergie/dissipation de chaleur plus faible, le tout à des prix inférieurs.
Les capteurs CMOS continuent de se développer rapidement. Une technologie appelée Backside Illumination (BSI) a trouvé sa place dans les capteurs d'images industriels. Cette technologie crée une inversion de la structure du pixel pour présenter la photodiode sensible à la lumière directement sous les micro-lentilles, ce qui augmente considérablement l'efficacité quantique des pixels.
Monochrome ou couleur
Les caméras monochromes sont généralement préférées pour les applications de fluorescence en raison de leur efficacité quantique plus élevée. Le facteur technique à l'origine de cette différence est que dans les caméras couleur, les microfiltres de Bayer placés sur chaque pixel ne laissent passer que certaines longueurs d'onde. Ce filtrage est nécessaire pour calculer les informations sur les couleurs de l'image par un processus appelé débayerisation. Comme les filtres de couleur bloquent une certaine quantité de lumière, moins de photons atteignent la zone photo-réactive du pixel. Outre le motif de Bayer sur les capteurs, le filtre IR des caméras couleur constitue un facteur limitant car il bloque la lumière d'environ 650 à 700 nm vers le haut (figure 2).
Généralement, les images comportant plusieurs marqueurs de fluorescence pour la détection spécifique et la colocalisation des molécules d'intérêt sont réalisées à partir d'images séparées à l'aide de caméras monochromes. Des sources lumineuses et des jeux de filtres sélectionnables fournissent la bonne combinaison de longueurs d'onde d'excitation et d'émission pour chaque fluorophore utilisé (figure 3).
Cependant, certaines applications peuvent créer une demande d'imagerie couleur et de fluorescence au sein d'un seul instrument utilisant une seule caméra. Cela est possible si les exigences de sensibilité de l'application de fluorescence ne sont pas trop élevées.
Global et Rolling Shutter
Les capteurs CCD n'ont qu'un seul type d'obturateur (global) alors que les capteurs CMOS sont disponibles en deux types : rolling et global. Le choix du bon capteur a un impact significatif sur la qualité de l'image, en particulier lorsque les objets ciblés sont en mouvement.
Dans les capteurs rolling shutter, les pixels sont exposés ligne après ligne. Par conséquent, un objet qui a changé de position entre la capture du signal de deux lignes produit des situations d'image divergentes, générant une distorsion de l'espace dans l'image. Un avantage technique des capteurs à obturateur roulant est qu'ils comportent moins de pièces électroniques dans le pixel, ce qui peut réduire le bruit lors de la lecture.
Les capteurs global shutter exposent tous les pixels du capteur en même temps. Dans ce cas, il n'y a pas de décalage temporel entre les expositions des différentes lignes de pixels, ce qui permet d'éviter les distorsions spatiales lorsque les objets se déplacent.
Sensibilité et gamme dynamique
Avant d'examiner de plus près la qualité d'une image, il est important de s'assurer que le système est suffisamment sensible pour capturer les signaux de fluorescence, qui peuvent être très faibles, en fonction de l'application individuelle.
La sensibilité doit être comprise comme la quantité minimale de lumière nécessaire pour générer un signal qui peut être distingué du bruit.
Une valeur importante est l'efficacité quantique (QE), qui décrit le rapport entre les photons incidents de la source lumineuse et les électrons générés par le pixel. Elle dépend de la longueur d'onde et, pour obtenir le meilleur résultat, le spectre d'un capteur donné doit correspondre aux spectres d'émission des fluorophores dans l'application. Plus le QE est élevé, meilleur est le rendement des photons, ce qui permet de raccourcir les temps d'exposition, de réduire le photoblanchiment des fluorophores et, éventuellement, d'améliorer la vitesse globale de l'imagerie.
Souvent, il est également utile de disposer d'une large gamme d'intensités lumineuses qui peuvent être résolues en une seule exposition. Dans ce cas, la full well capacity est importante. Elle décrit le nombre maximal d'électrons pouvant être générés par un pixel par exposition. Plus la capacité du puits complet est élevée, plus la quantité de lumière capturée avant qu'un pixel ne soit saturé est importante, ce qui réduit la nécessité d'expositions supplémentaires en raison de la saturation.
En combinant le nombre maximal d'électrons et le nombre minimal d'électrons requis pour produire un véritable signal (voir "bruit de lecture" dans la section suivante), la plage dynamique caractérise la capacité globale d'une caméra à mesurer et à distinguer différents niveaux de lumière.
Enfin, il y a le seuil de sensibilité absolue, qui est le nombre de photons requis par un pixel pour générer un rapport signal-bruit (RSB) de 1.
- ce qui signifie que le signal est équivalent au bruit. Plus cette valeur est petite, moins il faut de lumière pour produire un véritable signal. Comme il ne tient pas compte de la taille des pixels, il ne peut pas être utilisé directement pour comparer deux caméras dont les tailles de pixels sont différentes.
Qualité de l'image et bruit
Le bruit est l'écart entre la valeur réelle du signal et la valeur produite par un système de mesure. Le RSB quantifie le bruit global d'un système d'imagerie à un certain niveau de lumière et est un paramètre couramment utilisé pour comparer les caméras.
Dans le processus d'imagerie, certains types de bruit ne peuvent que rarement - voire pas du tout - être réduits par la technologie de la caméra (par exemple, photon/shot noise, qui est causé par l'apparence physique des photons). Cependant, d'autres types de bruit qui influencent la qualité de l'image sont fortement influencés par le capteur lui-même et la technologie de la caméra. Ces dernières années, les capteurs CMOS modernes ont surpassé l'ancienne technologie CCD en termes de qualité d'image et de performances.
Une autre source de bruit pertinente pour les applications de fluorescence devient importante lorsque les temps d'exposition augmentent ; elle est causée par le courant d'obscurité.
Les types de bruit qui décrivent un comportement non pas temporel mais spatial sont appelés fixed-pattern noise ; ils décrivent les écarts qui peuvent être observés entre différents pixels. Il peut être causé par l'électronique du pixel ou par des températures irrégulières sur la zone du capteur.
Les mesures de quantification normalisées de ces types de bruit sont le DSNU (dark signal nonuniformity), qui décrit la déviation des électrons générés sans aucun signal lumineux, et le PRNU (photoresponse nonuniformity), qui décrit la déviation pixel à pixel à un certain niveau de luminosité. En fixant des valeurs limites pour les écarts de pixel à pixel, il est possible de différencier et de décrire les pixels aberrants comme des pixels défectueux, tels que les pixels chauds, qui affichent des valeurs de gris élevées sans signal correspondant. Certains fabricants de caméras corrigent déjà les pixels défectueux lors du contrôle de qualité par interpolation des pixels voisins, de sorte que les intégrateurs ne sont pas gênés par ces artefacts.
Interfaces
Il existe plusieurs interfaces sur le marché. Pour décider quelle interface est nécessaire, les points suivants doivent être pris en compte en fonction de l'application : débit de données/d'images, longueur du câble, normalisation, effort d'intégration et coûts. Les technologies d'interface USB 3.2 Gen 1 (anciennement USB 3.0), GigE Vision, et 5GigE Vision représentent l'état actuel de la technique pour l'intégration dans les systèmes basés sur la microscopie à fluorescence. Les normes Vision sont disponibles pour toutes les interfaces mentionnées et fournissent des spécifications développées par les principaux fabricants de caméras afin d'améliorer la conception, l'effort et la performance des systèmes de vision pour les intégrateurs de caméras.
L'USB 3.2 Gen 1 est l'interface plug-and-play conventionnelle et établie avec l'intégration la plus simple. Elle permet des débits de données d'environ 380 MB/s, ce qui signifie par exemple 75 images par seconde à 5 MP, ce qui est suffisant pour la plupart des applications. Les longueurs de câble allant jusqu'à plusieurs mètres, y compris l'alimentation, sont prises en charge, tout comme l'intégration de plusieurs caméras. L'USB 3.2 Gen 2 offre une largeur de bande environ deux fois supérieure à celle de Gen 1, mais les longueurs de câble sont légèrement plus courtes. Il est de plus en plus utilisé dans la pratique.
GigE est utilisé lorsque des câbles plus longs et une synchronisation plus précise de plusieurs caméras sont nécessaires. La bande passante du GigE classique est d'environ 100 MB/s. Avec 5GigE, une version environ cinq fois plus rapide est désormais disponible, comme celle déjà intégrée dans la série ace 2, par exemple. Le 10GigE double encore cette largeur de bande et permet d'atteindre une vitesse de transmission dix fois supérieure à celle du GigE classique. Ces variantes avec des largeurs de bande plus élevées nécessitent du matériel hôte et des périphériques compatibles, mais elles sont de plus en plus populaires sur le marché.
Refroidissement
La température du capteur a une influence centrale sur le courant d'obscurité, qui détériore le rapport signal/bruit et la qualité de l'image, en particulier lorsque les signaux lumineux sont faibles et que des temps d'exposition plus longs sont nécessaires. Cela signifie que le refroidissement des caméras peut être important, mais qu'il n'est pas absolument nécessaire pour l'imagerie de fluorescence. Les mesures de refroidissement ayant un impact significatif sur les coûts du système, la majorité des caméras ne sont pas activement refroidies, ce qui est déjà suffisant pour les applications avec de bons signaux de fluorescence. Mais même pour ces caméras, la conception influe sur la température du capteur. La génération de chaleur doit être évitée en faisant fonctionner la caméra avec une faible consommation d'énergie. En outre, la chaleur doit être efficacement évacuée vers l'extérieur grâce à la conception interne du matériel et au montage de la caméra sur un autre support dissipateur de chaleur.
Des éléments thermoélectriques (Peltier) sont utilisés pour refroidir activement un capteur et un ventilateur intégré dissipe généralement la chaleur générée par l'élément Peltier vers l'extérieur. Le ventilateur permet également d'éviter la condensation de l'humidité lorsque les températures tombent en dessous de la température ambiante. S'il est nécessaire d'éviter les vibrations (qui peuvent être causées par le ventilateur) dans le système, certaines caméras peuvent même être refroidies à l'eau.
Améliorations apportées par le micrologiciel
Au-delà des spécifications du matériel et du capteur, les appareils photo peuvent offrir des fonctions de microprogrammation qui améliorent la qualité de l'image dans des conditions de faible luminosité.
Un exemple est la correction des pixels défectueux. À cette fin, le fabricant fait fonctionner la caméra à différents temps d'exposition pendant l'inspection finale et les pixels défectueux sont localisés et stockés dans le cache de la caméra. En mode opérationnel, les valeurs des pixels défectueux sont interpolées par la somme pondérée des pixels voisins. Cela permet d'améliorer la qualité de l'image et le rapport signal/bruit.
Les générations actuelles de capteurs CMOS permettent des applications qui n'étaient pas possibles auparavant sans investir plusieurs milliers d'euros dans une caméra CCD. L'importance de ces nouvelles possibilités ne cesse de croître, car la fluorescence est un outil de plus en plus utilisé dans les sciences de la vie pour visualiser les structures et les processus.
La fluorescence sur le terrain
La fluorescence est un phénomène physique et pas seulement une technologie spécifique. Les méthodes possibles - par exemple pour l'analyse, les déterminations quantitatives ou les visualisations utilisées dans les sciences de la vie - sont presque infinies. Les fluorophores peuvent être couplés à divers supports tels que des protéines (souvent des anticorps), des acides nucléiques ou des microparticules. Mais ils peuvent également être intégrés comme marqueurs de technologie génétique dans les organismes afin d'examiner les fonctions et les processus cellulaires et biologiques. Outre les sciences de la vie, les méthodes basées sur la fluorescence sont également utilisées dans d'autres domaines, tels que l'analyse des matériaux ou la criminalistique. Les exemples suivants illustrent les multiples possibilités d'application de la fluorescence.
Dans le cadre du diagnostic in vitro des maladies auto-immunes ou infectieuses, la technologie de la microscopie à immunofluorescence indirecte peut être utilisée pour détecter des anticorps spécifiques dans le sang du patient.
Outre la microscopie manuelle, il existe déjà des systèmes automatisés qui suggèrent aux médecins de laboratoire des résultats basés sur les schémas de fluorescence des cellules incubées avec les sérums des patients, évalués par un logiciel (figure 6). Un autre système, quant à lui, analyse les sérums des patients sur les agents pathogènes du paludisme en moins de 3 minutes. L'analyse est effectuée à l'aide d'algorithmes basés sur la vision qui prennent également en compte les signaux de fluorescence.
Les systèmes de point de soins prennent de plus en plus d'importance dans le domaine du diagnostic médical. Ils permettent notamment de mettre en place de meilleurs soins médicaux, même dans les régions économiquement et infrastructurellement faibles, grâce à des applications simples et peu coûteuses. Les technologies de laboratoire sur puce permettent le traitement d'échantillons de patients sur une petite puce, sans nécessiter d'équipement de laboratoire complexe.
En microscopie chirurgicale, les chirurgiens sont de plus en plus aidés par les marques fluorescentes spécifiques des vaisseaux sanguins ou des tissus tumoraux, ce qui leur permet d'opérer avec une précision parfaite grâce à la chirurgie guidée par fluorescence.
Les sciences de la vie offrent un large éventail d'applications basées sur la fluorescence dans lesquelles les examens microscopiques occupent une place importante.
La miniaturisation et la parallélisation pour augmenter le nombre d'analyses sont particulièrement importantes dans la recherche pharmaceutique, étant donné qu'un très grand nombre d'échantillons sont analysés dans le cadre de la recherche de nouvelles substances actives. C'est là qu'interviennent les puces à ADN et les systèmes de criblage à haut contenu (figure 8).
Les compteurs automatiques de colonies permettent d'utiliser des marqueurs fluorescents dans les boîtes de Petri pour sélectionner les cellules transfectées avec succès et prélever ensuite un échantillon de la colonie concernée. Il est ainsi possible de vérifier si un matériel génétique particulier a effectivement été transféré dans la cellule dans le cadre d'une expérience, et les chercheurs peuvent continuer à l'utiliser pour leurs recherches.