Telecamere per microscopia a fluorescenza OEM
La microscopia a fluorescenza è un termine molto ampio che comprende numerose applicazioni. Queste spaziano dalle applicazioni di base nelle scienze della vita fino alle tecniche altamente sviluppate, in cui vengono rilevati e localizzati solo pochissimi fotoni o singole molecole grazie a hardware e software specifici di alto livello.
Sensori CMOS in applicazioni basate sulla fluorescenza
Quando si sceglie una telecamera per la microscopia a fluorescenza, è importante trovare un equilibrio tra alcune caratteristiche del sensore, gli aspetti legati alla telecamera e le esigenze delle applicazioni previste nei settori scientifico, medico o industriale.
Formato ottico e risoluzione
Quando si considera l’intervallo di lunghezze d’onda visibili, le valutazioni relative alla configurazione ottica non differiscono in modo significativo rispetto alle applicazioni di microscopia a luce normale, in termini di formato, ingrandimento e risoluzione. Tuttavia, è importante sapere che il costo complessivo aumenta quando si utilizzano formati ottici più grandi, come gli attacchi F-mount.
Il più comune è l’attacco C-mount, che offre un’ottima resa ottica e per il quale è disponibile la maggior parte dei prodotti e delle soluzioni a un prezzo ragionevole.
Il più piccolo S-mount rappresenta invece una buona scelta quando si sviluppano strumenti di dimensioni ridotte e con costi inferiori.
I sensori quadrati sono spesso preferibili per catturare la massima quantità di contenuto dell’immagine.
Poiché il sensore svolge un ruolo fondamentale in un sistema di imaging, è molto importante considerare attentamente le sue specifiche di prestazione al momento della scelta.
CCD, CMOS, sCMOS e BSI
Per molto tempo, i sensori CCD sono stati la tecnologia più diffusa sul mercato dei microscopi a fluorescenza. Negli ultimi anni la situazione è cambiata, anche se sono ancora disponibili nelle telecamere per microscopia di alta qualità. La più recente tecnologia CMOS è diventata sempre più diffusa negli ultimi anni ed è diventata competitiva anche rispetto alle particolari sfide del settore scientifico. I livelli di rumore sono ora paragonabili o addirittura migliori di quelli dei sensori CCD tradizionali. Allo stesso tempo, la nuova tecnologia consente di raggiungere velocità più elevate, risoluzioni più alte e un minore consumo di energia/dissipazione di calore, il tutto a prezzi inferiori.
I sensori CMOS continuano a svilupparsi rapidamente. Una tecnologia chiamata Backside Illumination (BSI) ha trovato spazio nei sensori di immagine industriali. Questa tecnologia crea un'inversione della struttura dei pixel per presentare il fotodiodo sensibile alla luce direttamente sotto le micro-lenti, aumentando in modo significativo l'efficienza quantica dei pixel.
Monocromatica o a colori
Le telecamere monocromatiche sono generalmente preferite per le applicazioni di fluorescenza grazie alla loro maggiore efficienza quantica.
Il fattore tecnico che determina questa differenza è che, nelle telecamere a colori, i microfiltri Bayer su ciascun pixel lasciano passare solo determinate lunghezze d’onda. Questo filtraggio è necessario per calcolare le informazioni cromatiche dell’immagine tramite un processo chiamato debayering.
Poiché i filtri colore bloccano una parte della luce, un numero inferiore di fotoni raggiunge l’area fotosensibile del pixel.
Oltre al pattern Bayer presente sui sensori, anche il filtro IR-cut delle telecamere a colori rappresenta un fattore limitante, poiché blocca la luce a partire da circa 650–700 nm (Figura 2).
In genere, le immagini con più marcatori fluorescenti, utilizzate per la rilevazione specifica e la co-localizzazione delle molecole di interesse, vengono realizzate a partire da immagini separate acquisite con telecamere monocromatiche.
Sorgenti luminose selezionabili e set di filtri forniscono la giusta combinazione di lunghezze d’onda di eccitazione ed emissione per ciascun fluoroforo utilizzato (Figura 3).
Tuttavia, alcune applicazioni possono richiedere la possibilità di effettuare riprese a colori e di fluorescenza all’interno di un unico strumento, utilizzando una sola telecamera.
Ciò è possibile solo se i requisiti di sensibilità dell’applicazione di fluorescenza non sono troppo elevati.
Otturatore globale o rolling
I sensori CCD dispongono di un solo tipo di otturatore (globale), mentre i sensori CMOS sono disponibili in due varianti: rolling shutter e global shutter.
La scelta del sensore più adatto ha un notevole impatto sulla qualità dell’immagine, soprattutto quando gli oggetti osservati sono in movimento.
Nei sensori rolling shutter, i pixel vengono esposti riga per riga.
Di conseguenza, un oggetto che cambia posizione tra la cattura del segnale di due righe produce differenze nell’immagine, generando distorsioni spaziali.
Un vantaggio tecnico dei sensori rolling shutter è che contengono meno componenti elettronici per pixel, il che può comportare minore rumore di lettura.
Al contrario, nei sensori global shutter, tutti i pixel del sensore vengono esposti simultaneamente.
In questo caso, non vi è alcuno sfasamento temporale tra l’esposizione delle diverse righe di pixel, evitando così distorsioni spaziali quando gli oggetti sono in movimento.
Sensibilità e gamma dinamica
Prima di analizzare più a fondo la qualità di un’immagine, è importante assicurarsi che il sistema sia sufficientemente sensibile da catturare i segnali di fluorescenza, che possono essere molto deboli a seconda dell’applicazione specifica.
La sensibilità va intesa come la quantità minima di luce necessaria per generare un segnale distinguibile dal rumore.
Un parametro importante è l’efficienza quantica (QE), che descrive il rapporto tra i fotoni incidenti provenienti dalla sorgente luminosa e gli elettroni generati dal pixel.
Essa dipende dalla lunghezza d’onda e, per ottenere il miglior risultato, lo spettro del sensore dovrebbe adattarsi agli spettri di emissione dei fluorofori utilizzati nell’applicazione.
Più alta è la QE, maggiore è la resa dei fotoni, il che consente tempi di esposizione più brevi, riduce il fotobleaching dei fluorofori e può migliorare la velocità complessiva di acquisizione delle immagini.
Spesso è utile anche disporre di un’ampia gamma di intensità luminose rilevabili con una singola esposizione.
In questo contesto è rilevante la full well capacity, ovvero la capacità massima di elettroni che un pixel può generare per ogni esposizione.
Maggiore è questa capacità, più luce può essere catturata prima che il pixel si saturi, riducendo così la necessità di ulteriori esposizioni dovute alla saturazione.
Combinando il numero massimo di elettroni con il numero minimo di elettroni richiesto per produrre un vero segnale (vedi “rumore di lettura” nella sezione successiva), la gamma dinamica descrive la capacità complessiva di una telecamera di misurare e distinguere diversi livelli di luce.
Infine, esiste la soglia di sensibilità assoluta, ossia il numero di fotoni necessari per pixel per generare un rapporto segnale/rumore (SNR) pari a 1,
ovvero quando il segnale è equivalente al rumore.
Più basso è questo valore, minore è la quantità di luce necessaria per produrre un vero segnale.
Poiché tale parametro non tiene conto della dimensione del pixel, non può essere utilizzato direttamente per confrontare due telecamere con dimensioni di pixel differenti.
Qualità dell’immagine e rumore
Il rumore è la deviazione tra il valore reale del segnale e il valore prodotto dal sistema di misura.
Il rapporto segnale/rumore (SNR) quantifica il rumore complessivo di un sistema di imaging a un determinato livello di luce ed è un parametro comune per confrontare le telecamere.
Maggiore è l’SNR, migliore sarà la qualità dell’immagine.
Nel processo di acquisizione dell’immagine esistono tipi di rumore che possono essere ridotti solo in minima parte — o per nulla — dalla tecnologia della telecamera (ad esempio il rumore fotonico o shot noise, causato dalla natura statistica dell’arrivo dei fotoni).
Tuttavia, altri tipi di rumore che influenzano la qualità dell’immagine dipendono in modo significativo dal sensore stesso e dalla tecnologia della telecamera.
Negli ultimi anni, la precedente tecnologia CCD è stata superata in termini di qualità dell’immagine e prestazioni dai moderni sensori CMOS.
Il rumore di lettura (o rumore termico temporale) è il rumore aggiunto a un segnale per ogni evento di esposizione ed è espresso in e¯/pixel (elettroni per pixel).
I sensori CMOS moderni possono raggiungere valori di rumore di lettura fino a soli 2 e¯/pixel (Figura 4).
Un’altra fonte di rumore rilevante per le applicazioni di fluorescenza diventa importante quando aumentano i tempi di esposizione; essa è causata dalla corrente oscura (dark current).
La corrente oscura rappresenta la perdita di elettroni durante l’esposizione ed è espressa in e¯/pixel/s (Figura 5).
Come regola generale, la corrente oscura raddoppia ogni aumento di temperatura di circa 7 °C.
I tipi di rumore che descrivono un comportamento spaziale piuttosto che temporale sono chiamati rumore a pattern fisso (fixed-pattern noise); esso rappresenta le deviazioni visibili tra pixel differenti.
Può essere causato dall’elettronica dei pixel oppure da variazioni di temperatura non uniformi sull’area del sensore.
Le misure di quantificazione standardizzate di questi tipi di rumore sono DSNU (Dark Signal Non-Uniformity), che descrive la deviazione degli elettroni generati in assenza di luce; e PRNU (Photoresponse Non-Uniformity): descrive la deviazione pixel-per-pixel a un determinato livello di illuminazione.
Impostando valori limite sulle deviazioni tra pixel, è possibile identificare e classificare i pixel anomali come pixel difettosi, ad esempio i pixel caldi (hot pixels), che mostrano valori di grigio elevati senza un corrispondente segnale luminoso.
Alcuni produttori di telecamere correggono già i pixel difettosi durante il controllo di qualità, mediante interpolazione dei pixel adiacenti, in modo che gli integratori non siano influenzati da tali artefatti.
Interfaccia
Esistono diverse interfacce sul mercato. Per decidere quale interfaccia è necessaria, è necessario considerare i seguenti punti a seconda dell'applicazione: velocità dei dati/immagini, lunghezza del cavo, standardizzazione, sforzo di integrazione e costi. Le tecnologie di interfaccia USB 3.2 Gen 1 (ex USB 3.0), GigE Vision e 5GigE Vision rappresentano l'attuale stato dell'arte per l'integrazione nei sistemi basati sulla microscopia a fluorescenza. Gli standard di visione sono disponibili per tutte le interfacce citate e forniscono specifiche sviluppate dai principali produttori di telecamere per migliorare la progettazione, l'impegno e le prestazioni dei sistemi di visione per gli integratori di telecamere.
USB 3.2 Gen 1 è l'interfaccia plug-and-play convenzionale e consolidata con l'integrazione più semplice. Consente velocità di trasferimento dati di circa 380 MB/s, il che significa, ad esempio, 75 fps a 5 MP, sufficienti per la maggior parte delle applicazioni. Sono supportate lunghezze di cavo fino a diversi metri, compresa l'alimentazione, così come l'integrazione di più telecamere. L'USB 3.2 Gen 2 offre una larghezza di banda circa doppia rispetto alla Gen 1, ma ha una lunghezza di cavo leggermente inferiore. È sempre più utilizzata nella pratica.
GigE viene utilizzato quando sono necessari cavi più lunghi e una sincronizzazione più precisa di più telecamere. L'ampiezza di banda del GigE classico è di circa 100 MB/s. Con 5GigE, è ora disponibile una versione cinque volte più veloce, come già integrato, ad esempio, nella serie Ace 2. Il 10GigE raddoppia nuovamente questa larghezza di banda, raggiungendo una velocità di trasmissione dieci volte superiore al GigE classico. Queste varianti con larghezze di banda superiori richiedono hardware e periferiche host compatibili, ma stanno diventando sempre più popolari sul mercato.
Raffreddamento
La temperatura del sensore ha un’influenza centrale sulla corrente oscura, che peggiora l’SNR e la qualità dell’immagine, soprattutto quando i segnali luminosi sono deboli e sono necessari tempi di esposizione più lunghi.
Questo significa che il raffreddamento delle telecamere può essere importante, ma non è assolutamente necessario nella microscopia a fluorescenza.
Poiché le misure di raffreddamento incidono significativamente sui costi del sistema, la maggior parte delle telecamere non è raffreddata attivamente, il che è già sufficiente per applicazioni con buoni segnali di fluorescenza.
Anche in queste telecamere, comunque, il design influenza la temperatura del sensore.
È importante evitare la generazione di calore operando la telecamera con basso consumo energetico.
Inoltre, il calore deve essere efficacemente trasportato verso l’esterno tramite il design interno dell’hardware e mediante il montaggio della telecamera su un supporto dissipante.
Gli elementi termoelettrici (Peltier) vengono utilizzati per raffreddare attivamente il sensore e di solito un ventilatore integrato disperde il calore generato dall’elemento Peltier verso l’esterno.
Il ventilatore aiuta anche a prevenire la condensa quando le temperature scendono al di sotto di quella ambiente.
Se è necessario evitare vibrazioni (che possono essere causate dal ventilatore) nel sistema, alcune telecamere possono persino essere raffreddate ad acqua.
Miglioramenti tramite firmware
Oltre alle specifiche dell’hardware e del sensore, le telecamere possono offrire funzionalità firmware che migliorano la qualità dell’immagine in condizioni di scarsa luminosità.
Un esempio è la correzione dei pixel difettosi.
A tal fine, il produttore fa funzionare la telecamera a diversi tempi di esposizione durante il controllo finale e individua i pixel difettosi, memorizzandoli nella cache della telecamera.
In modalità operativa, i valori dei pixel difettosi vengono interpolati mediante la somma ponderata dei pixel vicini, migliorando così la qualità dell’immagine e l’SNR.
Le generazioni attuali di sensori CMOS permettono di realizzare applicazioni che in passato non erano possibili senza investire diverse migliaia di euro in una telecamera CCD.
L’importanza di queste nuove possibilità continua a crescere, poiché la fluorescenza sta diventando uno strumento sempre più utilizzato nelle scienze della vita per visualizzare strutture e processi.
Fluorescenza sul campo
La fluorescenza è un fenomeno fisico e non solo una tecnologia specifica.
I possibili metodi – ad esempio per analisi, determinazioni quantitative o visualizzazioni utilizzate nelle scienze della vita – sono quasi infinite.
I fluorofori possono essere accoppiati a diversi vettori, come proteine (spesso anticorpi), acidi nucleici o microparticelle.
Possono anche essere integrati come marcatori di tecnologia genetica negli organismi per studiare funzioni e processi cellulare-biologici.
Oltre alle scienze della vita, i metodi basati sulla fluorescenza sono utilizzati anche in altri ambiti, come l’analisi dei materiali o la scienza forense.
Gli esempi seguenti mostrano le versatili possibilità di applicazione della fluorescenza.
Nella diagnostica in vitro di malattie autoimmuni o infettive, la tecnologia della microscopia a immunofluorescenza indiretta può essere utilizzata per rilevare anticorpi specifici nel sangue del paziente.
Oltre alla microscopia manuale, esistono già sistemi automatizzati che forniscono ai medici di laboratorio risultati suggeriti basati sui pattern di fluorescenza delle cellule incubate con i sieri dei pazienti, come valutato dal software (Figura 6).
Un altro sistema, invece, analizza i sieri dei pazienti per i patogeni della malaria in meno di 3 minuti.
L’analisi viene effettuata con algoritmi basati sulla visione, che considerano anche i segnali di fluorescenza.
I sistemi point-of-care stanno assumendo un ruolo sempre più rilevante nella diagnostica medica.
Tra le altre cose, essi permettono di fornire cure migliori anche in regioni economicamente e infrastrutturalmente svantaggiate, grazie a applicazioni semplici ed economiche.
Le tecnologie lab-on-a-chip consentono di processare campioni dei pazienti su un piccolo chip, senza necessità di attrezzature complesse da laboratorio.
Nella microscopia chirurgica, i chirurghi sono sempre più supportati da marcatori fluorescenti specifici di vasi sanguigni o tessuti tumorali, permettendo loro di operare con precisione perfetta mediante chirurgia guidata dalla fluorescenza.
Anche i dentisti possono offrire trattamenti più rapidi e specifici, ad esempio visualizzando selettivamente le aree dei denti colpite dalla carie durante la terapia.
Ultimo, ma non meno importante, le applicazioni di microscopia a fluorescenza sono utilizzate in patologia per esaminare i tessuti derivati da biopsie dei pazienti alla ricerca di eventuali malattie.
Le scienze della vita offrono un ampio ventaglio di applicazioni basate sulla fluorescenza, nelle quali gli esami microscopici hanno un ruolo significativo.
La microscopia a immunofluorescenza permette di rilevare specificamente particolari proteine, ad esempio per localizzarle nelle cellule e nei tessuti o come marcatori di morte cellulare iniziale, a seconda delle condizioni specifiche del test (Figura 7).
Oggi, è possibile anche effettuare la live cell imaging per periodi prolungati utilizzando sistemi automatici.
La miniaturizzazione e la parallelizzazione per aumentare il numero di analisi sono particolarmente significative nella ricerca farmaceutica, poiché viene analiticamente esaminato un numero molto elevato di campioni nella ricerca di nuove sostanze attive.
In questo contesto vengono utilizzati microarray e sistemi di high-content screening (Figura 8).
Con contatori automatici di colonie, i marcatori fluorescenti possono essere impiegati nelle piastre Petri per selezionare le cellule correttamente trasfettate, al fine di prelevare successivamente un campione della colonia corrispondente.
In questo modo si verifica se un particolare materiale genetico è stato effettivamente trasferito nella cellula nell’ambito di un esperimento, permettendo ai ricercatori di proseguire con le loro ricerche.