蛍光顕微鏡用カメラ

CCD、CMOS、sCMOS、BSI

従来の蛍光顕微鏡に広く採用されてきたCCDセンサーは、今でも一部のハイエンド向け顕微鏡カメラに搭載されることがありますが、CMOSセンサーの登場により、その姿を徐々に消しつつあります。特に最新モデルのCMOSセンサーは、ノイズ、速度、画素数、消費電力、放熱性、コストの面で従来のCCDセンサーと同等またはそれ以上の性能を有していることから、ライフサイエンス分野の高度な用途において存在感を増しています。

進化を続けるCMOSセンサーのうち、産業用途にも活用されている裏面照射（BSI）型CMOSセンサーは、構造そのものを裏返し、マイクロレンズの真下に受光部のフォトダイオードを配置することにより、量子効率を大幅に向上させています（図1）。

ノイズは、本来の信号と機器の発する信号が区別できない場合に発生します。特定の輝度における画像処理システム全体のノイズ量を示す数値を「SN比」と呼び、数値が大きいほど画質が高くなることから、カメラ性能の比較に広く使用されています。画像処理の工程で発生するノイズの中には、光子の形状が原因のショットノイズ（フォトンノイズ）など、カメラ側での低減が難しいものも存在します。しかし、画質の低下につながるほかのノイズについては、センサーやカメラが大きく影響しています。最近では、画質や性能の面で従来のCCDセンサーを上回るCMOSセンサーも見かけられるようになりました。撮影1回当たりの信号に含まれるノイズの量を評価する指標として「読み出しノイズ（テンポラルダークノイズ）」があり、「e-」の単位で表されますが、最新のCMOSセンサーの場合、この読み出しノイズが2e-まで低下しています（図4）。

ほかに蛍光観察の際にノイズの原因になるものとして、露光時間の増加による「暗電流」の発生が挙げられます。暗電流は、露光中に電子が漏れ出たもので、こちらも「e-」の単位で表されます（図5）。また、暗電流には、温度が7°C上昇するごとに倍増するという特性があります。このように一時的な現象ではなく、周囲の環境によって変化するノイズを「固定パターンノイズ」と呼び、電荷量やセンサー面の温度の違いで発生するため、ピクセルごとにばらつきが見られます。一般的な暗電流の測定では、入光がない状態で生成された電荷量のばらつきを示す「暗出力不均一性（DSNU）」と、一定の光量におけるピクセル間のばらつきを示す「感度不均一性（PRNU）」を評価します。その際、判断基準となる閾値を設けることで、信号なしで白く表示されるホットピクセルを含め、ドット抜けを検出できます。多くのカメラメーカーでは、品質管理の工程において周囲のピクセルによる補正処理を行うなど、ドット抜けによる不具合が発生しないように対策を講じています。

“蛍光”はある特定の技術ではなく、単なる物理現象を指すこともあり、その用途は、ライフサイエンス分野における分析、定量的測定・可視化など、無限に存在します。蛍光物質は、タンパク質（抗体）、核酸、微粒子などのキャリアと組み合わせることができるほか、遺伝子マーカーとして組織の中に取り込み、細胞生物学的な機能やプロセスを観察することも可能です。また、物質分析や科学捜査など、ライフサイエンス以外の分野で蛍光観察が採用されることもあります。蛍光観察のさまざまな活用事例を以下にまとめました。

自己免疫疾患や感染症の体外診断では、間接免疫蛍光顕微鏡観察と呼ばれる方法を使用して患者の血液中に存在する自己抗体を検査します。

その際、手動顕微鏡以外にも、患者の血清から培養した細胞の蛍光パターンをソフトウェアで分析し、その結果を臨床検査技師に提供する自動システムがすでに登場しています。さらに、患者の血清中にあるマラリアの病原体を3分以内に検出するシステムもあり、蛍光信号を検知する画像処理アルゴリズムを使用して分析が行われています。

このほか、ポイントオブケア（POC）システムもますます注目を集めるようになっており、シンプルかつ安価であることから、経済やインフラが不安定な地域における医療の改善などに貢献しています。また、ラボオンチップ（LOC）技術により、複雑な研究機器がなくても、小さなチップの上で患者のサンプルを処理することが可能になっています。

手術用顕微鏡を使用した手術では、特殊な蛍光色素を使用して腫瘍組織を染色することにより、高い精度で手術を行うことができます。歯科においても、虫歯のある部分を蛍光で可視化することにより、よりスピーディーで専門的な処置を行えるようになっています。そして何より、病理検査では、患者の生体組織を観察し、病気を診断するために蛍光顕微鏡が使用されています。

ライフサイエンス分野では、幅広い用途で蛍光観察が行われていますが、その中でも顕微鏡用途は特に大きなシェアを占めています。免疫蛍光顕微鏡では、特殊な方法で特定のタンパク質を検出することにより、細胞や組織内におけるタンパク質の位置を調べたり、特定の試験環境下において細胞死が始まっている部分に標識を付けたりすることができます（図7）。最近では、生細胞の長時間観察を自動的に行うシステムも登場しています。

特に医薬研究においては、新しい作用物質を研究する際に膨大な数のサンプルの分析とスクリーニングを行うため、マイクロアレイやハイコンテントスクリーニングシステムを使用し、小型化や並列化によって分析数を増加させることが非常に重要です（図8）。このほか、自動コロニーカウンターを使用すれば、蛍光物質を用いてトランスフェクションされた細胞をシャーレの中で選別し、各コロニーのサンプルをピックアップすることができます。つまり、試験の一環として特定の遺伝子物質を細胞内に導入した後でも、引き続きその細胞を研究に使用できることが証明されているのです。